جلسه دفاع از پایان نامه کارشناسی ارشد در رشته ژنتیک پزشکی- خانم منيژه ايزدي

جلسه دفاع از پایان نامه کارشناسی ارشد در رشته ژنتیک پزشکی- خانم منيژه ايزدي

26 آذر 1387

چکیدهپديده RNAi براي اولين بار در سال 1998 معرفي گرديد که بر پایه کاهش بیان ژنها به صورتSequence specific و به واسطه Double stranded RNA (dsRNA) بود که موجب تخریب mRNA حاوی توالی یکسان با dsRNA می گردید. عامل فعال این پروسه مولكول RNA كوچك و دو رشته اي به نام short interfering RNA (siRNA)مي باشد. با وجودی که مدت زمان کمی از معرفی این پدیده می گذرد، RNAi استفاده های فراوانی در زمینه تحقیقات پایه و کلینیکی یافته است. با استفاده از RNAi عملکرد بسیاری از ژنهاي انسانی و غیر انسانی مشخص شده است. بعلاوه، استفاده از اين روش در درمان برخي اختلالات تك ژني، سرطان و عفونتهاي ويروسي پيشنهاد گرديده است.استفاده از siRNA در داخل سلول می تواند به دو طریق صورت گیرد: وارد کردن دوبلكسهاي سنتتیک siRNA به داخل سلولهاي هدف و يا بیان siRNA در داخل سلول (به وسیله یک وکتور بیانی، یک ویروس تغییر یافته و یا به وسیله قراردادن یک ترنسژن در داخل ژنوم سلول). بيان داخل سلولي siRNA، با وجود هزینه اندک، بیان ثابت و پایدار siRNA را به دنبال داشته و طبیعتاً تجزيه و تحليل فنوتیپ حاصل را به صورت دقیق و قابل اطمینان ممکن می سازد. هدف از پروژه حاصل طراحي و بكارگيري يك روش vector-based جهت بيان siRNA و كاهش بيان ژن هدف در سلولهاي انساني مي باشد.ژن GFP به عنوان ژن هدف برای کاهش بیان انتخاب شد. قطعه حاوی ژن GFP از وکتور pEGFP-N1 جدا گردیده و در وكتور pcDNA 3.1/His/LacZ کلون گردید. وکتور نوترکیب حاصل حاوی ژن مقاومت به آنتی بیوتیک نئومایسین است. این وکتور به کمک برش آنزیمی خطی شده و از طریق الکتروپوریشن وارد سلولهای Hek 293 گردید. سپس جهت انتخاب سلولهای ترنسژن شده، از محیط حاوی آنتی بیوتیک G418، برای کشت و پاساژهای بعدی سلولهای الکتروپوریت شده استفاده گردید. بعد از پنج مرتبه پاساژ، جمعیت یکنواختی از سلولها با بیان پایدار GFPحاصل گردید. جهت ساخت وکتور بیان کننده siRNA علیه GFP، اليگو نوكلئوتيدهاي مناسب siRNA عليه ژن GFP طراحي شدند. هر جفت الیگوی مکمل، دو رشته ای شده و فسفریله گردیدند. قطعات دو رشته ای حاصل، در جلو یک پرموتور U6، در وكتور U6/PBS كلون گرديدند تا وکتور siRNA-GFP حاصل گردد. کارائی وکتور siRNA-GFP، در میزان کاهش بیان GFP در سلولهای Hek 293 با بیان پایدار GFP بررسی گردید. وکتور فوق به داخل سلولها ترنسفکت شده، و پس از 24 ساعت سیگنال GFPدر زیر میکروسکوپ فلورسنت مشاهده شد و عکسبرداری صورت گرفت. میزان بیان GFP در عکسهای مختلف با استفاده از نرم افزارMultianalyst کمی گردید.بطور خلاصه، در اين تحقيق وكتور جديدي جهت بيان GFP حاصل شد که حاوی ژن مقاومت به آنتی بیوتیک نئومایسین است و به کمک آن رده سلولی Hek 293 با بیان پایدار GFP ایجاد گردید. همچنین وکتور siRNA-GFP ساخته شد و کارایی آن در کاهش بیان ژنGFP نشان داده شد. این وکتور 97-79 درصد بیان GFP را در سلولهای Hek 293 با بیان پایدار GFP کاهش داد.مرحله بعدی این مطالعه با اضافه کردن توالیهای LoxP در وکتور siRNA-GFP در حال انجام است. با ساخت وکتور جدید و استفاده از سيستم نوترکیبی Cre-LoxP، به بیان کنترل شده siRNAعلیه GFP دست خواهیم یافت. این سیستم قدم اولیه ای در بیان کنترل شده siRNA به عنوان یک ابزار درمانی in vivo می باشد.واژگان کلیدی: siRNA، GFP، Cre-LoxP system

نظرات

سوال

captcha

لیست نظرات

5/5 0 0 0